Сравнительное исследование определения HER2-статуса рака молочной железы методами иммуногистохимии и in situ гибридизации

Успехи в лечении онкологических заболеваний во многом связаны с появлением в химиотерапии препаратов направленного (таргетного) действия. Одним из таких препаратов является Трастузумаб (Герцептин – "Хоффман Ля Рош Лтд.", Базель, Швейцария), широко применяющийся при лечении рака молочной железы (РМЖ) и изучаемый для лечения рака других локализаций [1, 12]. Высокая эффективность Герцептина связана с механизмами его действия – цитотоксичностью, блокированием пролиферации, стимулированием апоптоза, антиангиогенной активностью [14]. Трастузумаб представляет собой рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело, связывающееся с рецепторами HER2/neu на поверхности опухолевых клеток [1]. Онкоген HER2 (human epidermal growth factor receptor-2 [7] – рецептор 2-го типа человеческого эпидермального фактора роста; синонимы: HER2/neu [8], Erb B27 [8, 9] и p 185HER2 [2]) расположен в хромосоме 17 (17q21) и кодирует белок – трансмембранную тирозинкиназу размером 185 кДа. Данный белок обладает 44% гомологией с рецептором эпидермального фактора роста (ЭФР) [3, 7]. HER2/neu относят к семейству тирозинкиназных рецепторов ERBB, которое состоит из четырех функционально взаимосвязанных рецепторных молекул, играющих важную роль в пролиферации, апоптозе и дифференцировке клеток. Это семейство включает эпидермальный фактор роста (EGF или ERBB1), ERBB2 (HER2/neu), ERBB3, ERBB4 [9, 16, 17]. Под воздействием лигандов HER2/neu образует гетеро- и гомодимеры с рецепторами этого семейства и оказывает прямое воздействие на работу ряда сигнальных каскадов, таких как MAPK и PI3K [11, 20]. При гиперэкспрессии белка и/или амплификации гена его влияние может резко усиливаться. Гиперэкспрессия HER2/neu обнаружена в 20–30% инвазивного протокового РМЖ, а в случаях неинвазивного рака эта величина достигает 90% [17, 19]. Знание состояния гена HER2/neu и уровня экспрессии белка HER2/neu имеет важное значение для определения прогноза у больных инвазивным РМЖ и для отбора пациентов с наличием гиперэкспрессии HER2/neu и/или амплификации гена HER2/neu для лечения трастузумабом, так как только в этих условиях показана эффективность препарата [8, 14, 15, 16]. Поэтому все большее значение приобретают точные, прямые и стандартные методы определения наличия гиперэкспрессии и/или амплификации HER2/neu.
В настоящее время существует несколько методов выявления гиперэкспрессии HER2/neu и/или амплификации гена HER2/neu: иммуногистохимический (ИГХ), гибридизация in situ (флюоресцентная и хромогенная), полимеразная цепная реакция. Однако на практике доминирующее положение занимает ИГХ-метод определения HER2-статуса РМЖ [2, 3]. Исследование проводится на гистологических срезах материала опухоли, залитого в парафин, с использованием нескольких видов поли- и моноклональных антител разных фирм-производителей ("Dako", "Novocastra", "Ventana"), обладающих различной чувствительностью, и нескольких типов систем визуализации. В то же время существует готовый стандартный набор для фармакодиагностики HER2/neu – "HercepTest" ("Dako"). При неопределенном иммуногистохимическом HER2-статусе (2+) требуется исследование, выявляющее наличие или отсутствие амплификации [6]. Такими методами являются флюоресцентная in situ гибридизация (FISH) и хромогенная in situ гибридизация гена (CISH) [2, 3, 4, 13]. Оба метода выполняются на срезах с того же образца (блока), на котором проводилось ИГХ-исследование. При FISH-гибридизации наличие амплификации гена HER2 оценивается путем подсчета соотношения красных (соответствующих помеченному гену HER2) и зеленых флюоресцентных сигналов, которыми помечен центромерный участок 17-й хромосомы. Соотношение больше 2 свидетельствует о наличии амплификации HER2. Метод FISH является более чувствительным, так как позволяет напрямую оценивать наличие (или отсутствие) амплификации, но и гораздо более дорогостоящим, чем ИГХ, так как для его проведения требуется специализированное оборудование и наборы реагентов, выпускающиеся фирмами "Dako" и "Vysis". Кроме того, при предварительной обработке материала, согласно стандартному протоколу, сильно нарушается морфология клеток. Это затрудняет определение гистологического варианта рака, в частности дифференциальную диагностику карциномы in situ и инвазивного рака, что является принципиальным, так как герцепт-статус опухоли оценивается только в инвазивном компоненте. Также определенную трудность представляет невозможность хранения срезов с проведенной на них FISH как при комнатной температуре, так и при –18°С, из-за того что флюоресцентный сигнал очень быстро разрушается.
Относительно новой и более дешевой альтернативной FISH является метод CISH, основанный на пероксидазном хромогенном окрашивании. Он позволяет выявлять амплификацию гена HER2 под световым микроскопом и учитывать морфологическую картину ткани. Кроме того, срезы с проведенной на них CISH могут длительное время храниться в обычных условиях при комнатной температуре. Однако методика CISH имеет и некоторые недостатки. Во-первых, она является довольно новой и поэтому мало известна в большинстве лабораторий, а во-вторых, так же как и ИГХ, имеет свою "мертвую зону" при оценке результатов исследований. При использовании CISH (набор фирмы "Zymed") используется один зонд к гену HER2 и проводится подсчет сигналов, пометивших только копии амплифицированного гена. Если сигналов более 6, результат оценивается как положительный. В пограничных случаях (3–5 сигналов) возникает необходимость дополнительного проведения FISH, который позволяет определить количество хромосом, что влияет на результат в случаях анеуплоидии и полисомии опухолевых клеток.
Целью нашего исследования было изучение конкордантности определения гиперэкспрессии HER2/neu ИГХ-методом при использовании концентрированных антител к c-erbB2 (А0485, "Dako") и набора "HercepTest" ("Dako") и конкордантности наличия/отсутствия амплификации при ее определении методами флюоресцентной и хромогенной in situ гибридизации.

Материалы и методы
Материалом для исследования служили 80 образцов операционного материала инвазивного протокового РМЖ пациенток, проходивших лечение в МНИОИ им. П.А.Герцена. Ткань фиксировали 10% нейтральным формалином в течение 24 ч, проводили по стандартной методике с помощью проводящего аппарата STP 120 ("Zeiss"), заливали в парафин, готовили срезы толщиной 4 мкм, которые монтировали на высокоадгезивные стекла. Демаскировку антигена, согласно инструкции к набору "HercepTest", проводили в водяной бане при 95–98 оС в течение 40 мин в цитратном буфере рН 6,0, входящем в состав набора. Все последующие манипуляции выполнялись строго по инструкции к набору. При использовании концентрированных антител к c-erbB2 (А0485, "Dako") использовали разведение 1:400 и коммерческий цитратный буфер рН 6,0 ("Dako") для демаскировки, которую осуществляли в тех же условиях, что и при использовании набора "HercepTest".
Реакцию оценивали по общепринятой балльной системе, разработанной фирмой-производителем набора и одобренной FDA [2, 15]:
0 – полное отсутствие продукта реакции или при выявлении его на мембранах менее чем 10% клеток инвазивного рака;
1+ – окрашивание слабой интенсивности мембран более чем 10% клеток инвазивного рака;
2+ – окрашивание умеренной интенсивности мембран более чем 10% клеток инвазивного рака;
3+ – окрашивание яркой интенсивности всей мембраны клетки большинства клеток инвазивного рака.
Реакцию оценивали с использованием светового микроскопа при увеличении объектива 10, учитывали только мембранное окрашивание инвазивного компонента опухоли.
При оценке реакции 0/1+ герцепт-статус считается отрицательным и лечение Герцептином не применяется, при реакции 3+ – положительный и в том случае может назначаться лечение Герцептином, при реакции 2+ результат считается неопределенным и проводится FISH-исследование для выявления амплификации гена. При наличии амплификации герцепт-статус также считается положительным.
Исследование методом FISH проводили по стандартной методике к используемому набору HER2 FISH pharm DxTM Kit ("Dako"). Для денатурации при 82 оС в течение 5 мин и гибридизации (45 оС, 20 ч) применяли автоматический гибридайзер ("Dako"). Амплификацию оценивали с помощью флюоресцентного микроскопа при увеличении объектива 100. Оценку наличия/отсутствия амплификации проводили, подсчитывая соотношение красных и зеленых меток (соответствующих помеченным участкам гена HER2 и центромерного участка) в 20 ядрах. При соотношении красных к зеленым меткам ≥2 результат считали положительным.
Исследование методом CISH проводили с использованием коммерческого набора SPoT-Light® HER2 CISHTM ("Zymed"). Денатурацию и гибридизацию также проводили в автоматическом гибридайзере (денатурацию при 95 оС в течение 5 мин, гибридизацию при 37 оС  – в течение ночи). Для визуализации метки проводили иммунодетекцию. В качестве хромогена применяли ДАБ. Результат гибридизации оценивали с помощью светового микроскопа при увеличении объектива 40. Оценку наличия/отсутствия амплификации проводили путем подсчета количества меток в опухолевых клетках. Считали, что амплификация гена HER2 отсутствует, если в ядрах более 50% опухолевых клеток наблюдается от 1 до 5 сигналов, слабой – если в ядрах более 50% опухолевых клеток находится от 5 до 10 сигналов, сильной – если в большинстве ядер опухолевых клеток наблюдается более 10 сигналов или крупные кластеры гена HER2. Результаты, полученные после проведения FISH, сравнивали с таковыми после проведения CISH на одних и тех же срезах образцов и оценивали конкордантность результатов.

Результаты
Сравнение концентрированных антител к c-erbB2 и набора "HercepTest"
При использовании концентрированных антител к c-erbB2 отрицательный герцепт-статус (0/1+) был обнаружен в 20 случаях инвазивного протокового РМЖ, что полностью совпало с результатами, полученными при использовании набора "HercepTest" ("Dako"). FISH-исследование также во всех этих случаях выявило отсутствие амплификации гена (табл. 1).
B 40 образцах при использовании концентрированных антител к c-erbB2 был получен результат, оцененный как 2+ и требующий проведения FISH-исследования. Но при использовании набора "HercepTest" было получено расхождение результатов: лишь в 26 образцах оценка реакции совпала. В 4 случаях был найден положительный герцепт-статус 3+, в 8 – реакция была слабой интенсивности – 1+ , и в 2 случаях реакция полностью отсутствовала (0). При FISH-исследовании во всех образцах 3+ обнаружена амплификация гена, в случаях 0/1+ амплификация отсутствовала, а в группе 2+ амплификация была обнаружена в 10 образцах из 26, в 16 – отсутствовала (табл. 1).
В группе из 20 образцов, оцененных по ИГХ с антителами к c-erbB2, как случаи с положительным герцепт-статусом 3+ (рис. 1), при использовании набора "HercepTest" в 14 случаях подтверждена оценка 3+, в 5 образцах получена интенсивность реакции 2+, а в одном образце герцепт-статус признан отрицательным – реакция 1+ (табл. 1). FISH показала наличие амплификации в 13 наблюдениях из 14, имеющих ИГХ-оценку 3+ и в 1 образце из 5, имеющих оценку 2+. В остальных случаях амплификация не обнаружена (табл. 1).
В результате проведенного исследования с использованием концентрированных антител к c-erbB2 и набора "HercepTest" герцепт-статус совпал в 60 образцах из 80, т.е. конкордантность результатов, полученных этими методами, совпала в 75% случаев и расхождение составляло 25%. Анализ этих данных показывает полное совпадение результатов обоих методов и результатов FISH в группе опухолей с отрицательным герцепт-статусом (0/1+), т.е. использование менее дорогостоящих концентрированных антител к c-erbB2 полностью позволяет выделять пациентов, которым не требуется лечение Герцептином. При этом в группе 2+ (по реакции с c-erbB2) концентрированные антитела увеличивают число образцов, в которых необходимо проводить FISH, в то время как по результатам реакции с набором "HercepTest" из 40 опухолей это дорогостоящее исследование показано только 26 образцам (4 опухоли оказались 3+, что подтверждается наличием амплификации, и 10 (25% ) случаев из группы 2+) (0/1+). В группе 3+ (по реакции с c-erbB2) "HercepTest" подтверждает оценку реакции в 14 опухолях из 20 (рис. 2). Исследование амплификации показывает ее наличие в 13 образцах (рис. 3), т.е. лечение Герцептином 7 пациентов было бы не оправданным и могло бы привести как к значительным экономическим потерям, так и нанести вред больным.
Наши данные сопоставимы с результатами других авторов: по данным литературы, дискордантность c-erbB2 и набора "HercepTest" составляет 15–25% [4, 5, 10]. В группах опухолей 3+ и 0/1+ (по данным "HercepTest") нами получено совпадение с результатами FISH-реакции в 95% наблюдений. В группе опухолей 2+ амплификация гена была обнаружена в 11 из 31 случая (2+ по данным "HercepTest"), т.е. примерно в 30%, что сходно с результатами, полученными рядом зарубежных авторов [6, 16].
Сравнение методов FISH и CISH 
В группе с HER2-статусом 2+ на 40 образцах инвазивного протокового РМЖ амплификация была также исследована методами FISH и CISH. По результатам СISH наличие амплификации гена HER2 было выявлено у 12 (30%) больных, (сильная амплификация – у 6 пациентов (15%) (рис. 4), слабая – также у 6 (15%) (рис. 5), и у 28 (70%) больных амплификации гена HER2 не выявлено (рис. 6).
Конкордантность методов FISH и СISH при инвазивном протоковом РМЖ составила 85% (табл. 2).
В настоящее время метод FISH признан в качестве "золотого стандарта" для определения HER2-статуса, а недавно разработанный и внедряемый метод СISH также становится все более популярным [4, 21]. Оба метода разработаны на основе прямой гибридизации меченого зонда с ДНК-мишенью, и, соответственно, оба метода имеют высокую чувствительность, что крайне важно для назначения Герцептина. Кроме того, у СISH есть и другие преимущества: простота использования и стоимость, так как для оценки результатов используется стандартный световой микроскоп, препараты переносят длительное хранение при комнатной температуре и могут в дальнейшем использоваться для пересмотра или уточнения диагноза. Однако, кроме очевидных преимуществ, СISH также имеет недостатки, некоторые из которых могут являться существенными при его использовании для массовой диагностики. Хромогенная гибридизация основана на монохромном окрашивании гибридизованного участка гена HER2, и при оценке результата подсчитывается только число таких участков, но не выявляется и не учитывается число центромерных участков 17-й хромосомы, в которой эти участки располагаются. Таким образом, случаи анеуплоидии и полиплоидии (полисомии) могут являться ложноположительным результатом, что может отражаться на эффективности применения Герцептина. В таких случаях FISH, как референсный метод, позволяет дифференцировать полиплоидные клетки от клеток с истинной амплификацией HER2. Поэтому конкордантность методов FISH и СISH не является полной. В нашей работе она составила 85%, что согласуется с результатами, полученными другими исследователями (от 84 до 100%) [6, 13, 16]. Только J.Zhao и соавт. показали 100% совпадение результатов [21], однако, они применяли одноцветную разновидность FISH, при которой, так же как и в случае с СISH, окрашивался только амплифицированный участок гена HER2.

Заключение
Таким образом, проведенное нами исследование показало, что использование концентрированных антител к c-erbB2 экономически оправдано лишь для выявления отрицательного герцепт-статуса РМЖ на больших когортах пациентов. Для выявления пациентов, подлежащих лечению Герцептином (при получении результата HER2-статуса опухоли 2+ или 3+), необходимо подтверждение результатов с помощью набора "HercepTest", а при повторении оценки 2+ обязательно требуется тестирование с помощью FISH-метода.
Конкордантность методов FISH с использованием двухцветных зондов (на участки центромеры 17-й хромосомы и гена HER2) и СISH с использованием монохромного зонда,  комплиментарного только участку HER2, составляет 85%. Следовательно, для окончательной диагностики наличия амплификации гена HER2 целесообразно использовать метод  FISH, так как получаемые с его помощью результаты более точно отражают истинный HER2-статус пациентки, что крайне важно для назначения таргетной терапии. Метод CISH позволяет с высокой вероятностью выделять группу опухолей с высокой амплификацией и может использоваться в отделениях патологической анатомии, не имеющих оборудования для флюоресцентного исследования. Образцы опухолей с низкой амплификацией гена должны в обязательном порядке повторно исследоваться с помощью метода FISH.
Данное исследование поддержано Представительством фармацевтической компании "Hoffman-La Roche" в России.

Реферат
Изучена конкордантность результатов иммуногистохимического исследования, выполненного с использованием концентрированных антител к c-erbB2 и набора "HercepTest". Исследование проведено на 80 образцах инвазивного протокового рака молочной железы с помощью иммуногистохимического метода и гибридизации in situ.
Конкордантность изученных методов составила 75%. Использование антител к c-erbB2 предлагается для проведения первичного скрининга рака молочной железы. Набор "HerceрTest" рационально применять для контроля больных с положительным герцепт-статусом.

Литература
1. Ганьшина И.П., Степанова Е.В. Рус. мед. журн. Онкология. 2003; 11 (11): 783–6.
2. Завалишина Л.Э., Франк Г.А. Морфологическое тестирование HER2-статуса. Методика и атлас. М.: Media medica, 2006.
3. Завалишина Л.Э., Франк Г.А. Рус. мед. журн. Онкология. 2006; 14 (24): 1737–9.
4. Bilous M, Dowsett M, Hanna W et al. Mod Pathol 2003; 16 (2): 173–82.
5. Bose S, Mohammed M, Shintake P, Rao PN. Breast 2002; 7 (5): 337–44.
6. Buyuk A, Turi GK, Flieder A. Mod Pathol 2006; 19 (3): 9.
7. Carter P, Presta L, Gorman CM et al. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89: 4285–9.
8. Cobleigh MA, Vogel CL, Tripathy D et al. Abstracts of ASCO 34th Annual Meeting 1998; 376.
9. Coussens L, Yang-feng TL, Liao Y-C et al. Science 1985; 230: 1132–9.
10. Crisi G, Gamelo S, Marconi S. Mod Pathol 2006; 19 (3): 10.
11. Esteva FJ, Hortobagyi GN, Sahin AA. Pathol Oncol Res 2001; 7 (3): 173–7.
12. Gong Y, Gilcrease M, Sneige N et al. Mod Pathol 2005; 18: 1015–21.
13. Hanna WM, Kwok K. Mod Pathol 2006; 19: 481–7.
14. Izumi Y, Xu L, di Tomaso E et al. Nature 2002; 416: 279–80.
15. Jacobs TW, Gown AM, Yaziji H et al. J Clin Oncol 1999; 17 (7): 1983–7.
16. Mass RD, Sander C, Chariene K et al. Abstracts of ASCO 36th Annual Meeting. 2000; 291.
17. O’Malley FP, Parkers R, Latta E et al. Am J Clin Pathol 2001; 115 (4): 504–11.
18. Park K, Kim J et al. Mod Pathol 2003; 16: 937–43.
19. Schechter AL, Hung M-C, Vaidyanathan L. Science 1985; 229: 976–8.
20. Slamon DJ, Glarn GM, Wong SG et al. Scinse 1987; 235: 177–82.
21. Zhao J, Wu R et al. Mod Pathol 2000; 15: 657–65.

Л.Э.Завалишина, Ю.Ю.Андреева, А.А.Рязанцева, М.В.Батева, Г.А.Франк

ФГУ Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А.Герцена Росмедтехнологии